ペプチド合成とは

 

ペプチド合成はタンパク質およびペプチド化学の活発な分野であり、通常、化学的方法によって定義された順序でアミノ酸を連続的に付加してペプチド鎖を形成することが含まれます。主な合成方法には液相合成と固相合成があります。 LPPS と比較して、SPPS には、より速く、より簡単で、副反応が少なく、収率が高いという利点があります。

 

Boc (ベンジル) および Fmoc (tBu) 戦略を含む標準 SPPS メソッド。

 

 

Boc（ベンジル）戦略

この合成アプローチでは、クロロメチル化、ヒドロキシメチル化ポリスチレンおよび p-メトキシベンジル (PMA) 樹脂が固体支持体として使用されます。 α-アミノ基はt-ブトキシカルボニル(Boc)で保護されており、アミノ酸の側鎖基はベンジル誘導体で保護されています。 Boc 基は、ニート TFA または CH2Cl2 中の TFA を使用して除去され、合成の最後に、側鎖保護基とペプチド樹脂結合が無水フッ化水素酸 (HF) や TFMSA などの強酸で除去されます。

 

Fmoc (tBu ) 戦略

この合成アプローチでは、Wang-resin、2-クロロトリチルクロリド樹脂、Rink アミド-AM 樹脂、Rink アミド-MBHA 樹脂が固体支持体として使用されます。α-アミノ基は、9-フルオレニルメトキシカルボニル (Fmoc) で保護されています)、一方、アミノ酸の側鎖グループは酸に不安定な保護基で保護されています。 Fmoc 基は DMF 中の 20% ピペリジンを使用して除去され、合成の最後に側鎖保護基とペプチド樹脂結合は 1%-95% TFA で除去されます。 Fmoc SPPS は現在、ペプチド合成に推奨されている方法です。

 

Fmoc固相ペプチド合成の基本原理

 

樹脂を選ぶ

Fmoc SPPS で最も広く使用されている樹脂には、4-アルコキシベンジル アルコール (Wang) 樹脂、2- 塩化クロロトリチル樹脂、Rink Amide 樹脂、Rink Amide-MBHA 樹脂などがあります。アミド樹脂は、必要な C 末端アミド化を伴うペプチドの合成に使用されます。 Wang 樹脂と 2-Cl Trt 樹脂は、必要な C 末端遊離 COOH を含むペプチドの合成に一般的に使用されます。ただし、ペプチドの C 末端の最初のアミノ酸が Pro と Gly である場合、DKP (ジケトピペラジン) 形成のリスクがあるため、Wang 樹脂は使用できません。2-クロロトリチル塩化物樹脂の使用が推奨されます。

 

 

保護されたアミノ酸の樹脂への結合

最初の Fmoc アミノ酸は、酸不安定性リンカーを介して不溶性支持樹脂に結合します。

 

-アミノ保護基の脱保護

ペプチジル樹脂のＮ末端にある一時的なＦｍｏｃ保護基は、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理することによって除去される。この反応は通常 10 ～ 20 分以内に終了します。

 

洗浄手順

各化学反応の後に、過剰な試薬、副生成物、未反応分子を樹脂から除去するために洗浄ステップが実行されます。これは、成長中のペプチド鎖の純度を維持するのに役立ちます。

 

保護されたアミノ酸の活性化とカップリング

樹脂に結合した保護されたアミノ酸は活性化されて、配列内の次のアミノ酸と結合する反応性が強化されます。一般的な活性化剤には、HOAt、HOBt、PyBOP、PyAOP、HBTU、HATU などがあります。カップリングには、活性化されたアミノ酸と成長するペプチド鎖のアミノ基との間のペプチド結合の形成が含まれます。カイザー テストは通常​​、カップリング反応の完全性を監視するために使用されます。

 

洗浄手順

前の洗浄ステップと同様に、これによりカップリング反応後の過剰な試薬と副生成物が確実に除去されます。

 

樹脂からの切断と側鎖保護基の脱保護

樹脂上で目的のペプチド配列が合成されたら、チオアニソールや水などのスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸（TFA）などの切断カクテルを使用して固体支持体から切断します。同時に、アミノ酸残基の側鎖保護基が除去され、完全に脱保護されたペプチドが明らかになり、精製と分析の準備が整います。