ペプチドの研究開発の領域では、カタログペプチドの純度が最も重要です。専用のカタログペプチドサプライヤーとして、顧客に高品質の製品を提供することの重要性を理解しています。時には、初期の合成と精製プロセスの最善の努力にもかかわらず、カタログペプチドのさらなる精製が必要になる場合があります。このブログでは、必要に応じてカタログペプチドをさらに浄化するためのさまざまな方法と考慮事項を検討します。
なぜさらに浄化するのですか？
カタログペプチドのさらなる精製が必要になる理由はいくつかあります。第一に、細胞ベースのアッセイ、in vivo研究、構造生物学研究などの非常に敏感な研究アプリケーションでは、微量の不純物でさえ、実験結果に大きな影響を与える可能性があります。不純物は、ペプチドの生物活性を妨げる可能性があり、誤検知または否定につながる可能性があります。
第二に、医薬品などの一部の業界での規制要件には、医薬品開発に使用されるペプチドに対して非常に高いレベルの純度を要求しています。ペプチドが潜在的な治療薬と見なされている場合、不純物は患者の安全性にリスクをもたらす可能性があるため、追加の精製ステップが不可欠です。
クロマトグラフィー方法
逆転 - 位相高 - パフォーマンス液体クロマトグラフィー（RP -HPLC）
RP -HPLCは、ペプチド精製のために最も広く使用されている方法の1つです。ペプチドを疎水性に基づいて分離します。 RP -HPLCの固定相は、疎水性材料であり、通常はアルキル鎖が取り付けられたシリカベースのカラムです（例えば、C18またはC8）。異なる疎水性を持つペプチドは、固定相と異なる相互作用を行い、その結果、保持時間が異なります。
RP -HPLCを使用してカタログペプチドをさらに精製するには、最初に適切な移動相を選択する必要があります。一般的な移動相は、水の混合物とアセトニトリルやメタノールなどの有機溶媒で構成され、ピーク形状を改善するために少量の酸（トリフルオロ酢酸、TFAなど）を添加します。有機溶媒の勾配を調整することにより、標的ペプチドの不純物からの分離を最適化できます。
たとえば、カタログペプチドがある場合LL-37、抗菌ペプチド、潜在的な治療用途を備えた抗菌性ペプチドであるRP -HPLCを使用して、残りの合成または劣化した断片を除去することができます。精製されたLL -37は、より正確な抗菌活性アッセイで使用できます。
イオン - 交換クロマトグラフィー
イオン - 交換クロマトグラフィーは、電荷に基づいてペプチドを分離します。 2つの主なタイプがあります。カチオン - 交換クロマトグラフィー（CEX）とアニオン - 交換クロマトグラフィ（AEX）。 CEXでは、固定相には負に帯電したグループがあり、正味の正電荷を持つペプチドがそれに結合します。 AEXでは、固定相が積極的に帯電し、負に帯電したペプチドが保持されます。
CEXとAEXの選択は、ペプチドの等電点（PI）に依存します。ペプチドのPIが移動相のpHを下回っている場合、ペプチドは正味の負電荷を持ち、AEXを使用できます。逆に、PIが移動相のpHを上回っている場合、CEXがより適切です。
例えば、ウレイスタチキニンII、特定の電荷プロファイルを持つペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製できます。移動相のpHとイオン強度を慎重に選択することにより、ターゲットペプチドを他の帯電した不純物から良好な分離を達成できます。
電気泳動法
ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS -Page）
SDS -Pageは主にタンパク質分析に使用されますが、ペプチド精製にある程度適用することもできます。 SDS -Pageでは、ペプチドはSDSによって変性され、分子量に基づいて分離されています。ペプチドは、電界の影響下でポリアクリルアミドゲルを介して移動します。
電気泳動後、ゲルを染色してペプチドを視覚化できます。標的ペプチドに対応するバンドは、ゲルから切除することができ、ペプチドはゲルマトリックスから溶出できます。ただし、この方法にはいくつかの制限があります。溶出プロセスは複雑である可能性があり、精製中にペプチドがある程度失われる可能性があります。また、SDSは、精製ペプチドから完全に除去することが困難です。
毛細管電気泳動（CE）
毛細管電気泳動は、ペプチドにとって強力な分離技術です。高い分離効率、短い分析時間、および低サンプル消費を提供します。 CEは、電荷と質量比に基づいてペプチドを分離します。毛細管ゾーン電気泳動（CZE）、毛細血管ゲル電気泳動（CGE）、ミセル電気動態クロマトグラフィー（MEKC）など、CEにはさまざまなモードがあります。
CZEは、ペプチド分析と精製に最も一般的に使用されるモードです。 CZEでは、ペプチドは電界の下で緩衝毛虫に分離されています。分離は、ペプチドの電気泳動移動度の違いに基づいています。 CEは、ペプチドの同定と精製の精度を改善するために、UV吸収、蛍光、質量分析などのさまざまな検出方法と組み合わせることができます。
その他の考慮事項
溶解度
ペプチドの溶解度は、精製プロセスの重要な要因です。ペプチドが精製溶媒の溶解度が低い場合、精製中に沈殿につながる可能性があり、それがペプチドの回復と純度に影響します。ペプチド溶解度を向上させるために、溶媒のpHを調整したり、CO -溶媒を追加したり、特定の溶解剤を使用したりできます。
純度分析
さらに精製した後、ペプチドの純度を分析することが重要です。純度分析の一般的な方法には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、質量分析（MS）、および核磁気共鳴（NMR）が含まれます。 HPLCはペプチドのクロマトグラフィー純度に関する情報を提供できますが、MSはペプチドの分子量を確認し、異なる質量の不純物を検出できます。 NMRは、原子レベルでのペプチドの構造と純度を決定するために使用できます。
結論
カタログペプチドサプライヤーとして、私たちはお客様に高品質のペプチドを提供することに取り組んでいます。カタログペプチドのさらに精製が必要な場合、クロマトグラフィー方法、電気泳動法、溶解度や純度分析などのその他の考慮事項など、さまざまな方法が自由に使用できます。適切な浄化方法を慎重に選択し、精製条件を最適化することにより、ペプチドがお客様の高い純度要件を満たすことを保証できます。
カタログペプチドのニーズがある場合、またはさらなる浄化サービスが必要な場合は、調達とディスカッションについてお気軽にお問い合わせください。ペプチドの研究開発ニーズを満たすために、お客様と協力することを楽しみにしています。
参照
- Snyder、LR、Kirkland、JJ、＆Dolan、JW（2010）。現代の液体クロマトグラフィーの紹介。ワイリー。
- Jorgenson、JW、＆Lukacs、KD（1981）。毛細血管ゾーンの電気泳動。分析化学、53（8）、1298-1302。
- Laemmli、英国（1970）。バクテリオファージT4のヘッドのアセンブリ中の構造タンパク質の切断。自然、227（5259）、680-685。