ちょっと、そこ！私はTET -213細胞のサプライヤーです。今日、これらの細胞に免疫蛍光染色を行う方法を説明します。免疫蛍光染色は、細胞生物学の世界で非常に有用な技術です。細胞内の特定のタンパク質を視覚化するのに役立ち、それらの機能と場所をよりよく理解することができます。
TET -213セルの準備
まず最初に、TET -213セルを準備する必要があります。適切な培地でそれらを栽培することから始めます。これらの細胞は通常、10％胎児ウシ血清（FBS）と1％ペニシリン - ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640のような媒体でうまく機能します。 37°Cの細胞を5％CO₂雰囲気でインキュベートします。
セルが約70〜80％のコンフルエンシーに達したら、染色プロセスを開始する時が来ました。 24枚の井戸プレートのカバースリップにセルをシードする必要があります。これにより、染色ステップ中に細胞を扱いやすくなります。ピペットを使用して、セルサスペンションをカバースリップに注意深く転送します。細胞を均等に分布させるようにしてください。
セルの固定
セルがカバースリップに取り付けられた後（通常は24時間後）、それを修正する時が来ました。固定は細胞構造を保存し、タンパク質を所定の位置に保つために重要です。リン酸塩 - 緩衝生理食塩水（PBS）で4％パラホルムアルデヒド（PFA）などの固定剤を使用できます。カバースリップ上のセルをカバーするのに十分なPFAを追加し、室温で約15〜20分間置きます。
固定が完了したら、細胞をPBSで3回洗浄します。各洗浄は約5分間持続するはずです。これにより、細胞から過剰な固定液を除去するのに役立ちます。
透過化
次は透過化です。このステップにより、抗体が細胞に入り、標的タンパク質に結合することができます。 PBSで0.1％Triton X -100のような透過剤を使用します。細胞に透過溶液を追加し、室温で約10分間インキュベートします。
その後、前のステップのように、細胞を再びPBSで3回洗浄します。これにより、透過剤が完全に除去されることが保証されます。
ブロッキング
ブロッキングは、抗体の非特定の結合を防ぐための重要なステップです。 PBSで5％ウシ血清アルブミン（BSA）などのブロッキングソリューションを使用できます。ブロッキングソリューションを細胞に追加し、室温で約1時間インキュベートします。
一次抗体インキュベーション
次に、一次抗体を追加する時が来ました。一次抗体は、TET -213細胞で検出するタンパク質に特異的です。製造元の指示に従って、ブロッキング溶液の一次抗体を希釈します。
細胞からブロッキング溶液を慎重に除去し、希釈した一次抗体を加えます。抗体溶液で細胞を完全に覆うようにしてください。 4℃で一晩で一次抗体で細胞をインキュベートします。この長いインキュベーション時間により、抗体は標的タンパク質に効果的に結合することができます。
翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、各洗浄は約5分間続きます。これにより、未結合の原発性抗体が取り除かれます。
二次抗体インキュベーション
一次抗体インキュベーションの後、二次抗体の時が来ました。二次抗体は蛍光色素で標識されているため、蛍光顕微鏡下で標的タンパク質を視覚化できます。
製造元の指示に従って、ブロッキング溶液の二次抗体を希釈します。細胞からPBSを除去し、希釈された二次抗体を加えます。室温で細胞を暗闇の中で約1〜2時間インキュベートします。暗い環境は、蛍光色素が衰退するのを防ぐために重要です。
インキュベーションが終わったら、前と同じように、細胞をPBSで3回洗浄します。
カウンターステイン
カウンターステインは、細胞核を視覚化するために使用されます。 Dapi（4 '、6 -Diamidino -2-フェニルインドール）のような染料を使用できます。 PBSでDAPIを希釈し、細胞に追加します。室温で約5分間インキュベートします。
その後、細胞をPBSでもう一度洗浄して、余分なDAPIを除去します。
取り付け
最後に、カバースリップを顕微鏡スライドに取り付ける時が来ました。取り付け培地を使用して、細胞を所定の位置に保つのに役立ち、蛍光も保存します。顕微鏡スライドに取り付け媒体を慎重に置き、カバースリップをドロップに反転させます。カバースリップとスライドの間に閉じ込められた気泡がないことを確認してください。
イメージング
これで、蛍光顕微鏡下で細胞を画像化する準備ができました。適切なフィルターを使用して、二次抗体とDAPIからの蛍光信号を視覚化します。さまざまな視野で複数の画像を撮影して、セルの適切な表現を取得できます。
プロセスで関連するペプチドを使用します
細胞培養と染色プロセス中に、いくつかのペプチドが有用であることもあるかもしれません。例えば、（gly14） - ヒューマニン（ヒト）細胞の生存率と機能にいくつかの有益な効果があることが示されています。それを培地に追加して、TETで研究しているタンパク質発現に影響するかどうかを確認できます-213細胞。
フィブロネクチンCS1ペプチドセルをシードする前に、カバースリップをコーティングするために使用できます。これにより、細胞の付着と広がりが強化され、染色プロセスがより効率的になります。
エンドテリン-1（11-21）TET -213細胞内のシグナル伝達経路でも役割を果たす可能性があります。培地に追加してから、免疫蛍光染色を介して標的タンパク質の発現にどのように影響するかを調べることができます。
結論
Tet -213細胞で免疫蛍光染色を実行することは少し難しいプロセスになる可能性がありますが、これらの手順に慎重に従うと、素晴らしい結果を得ることができるはずです。これは、これらの細胞の生物学に関する貴重な洞察を与えることができる強力な手法です。
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参照
- Alberts、B.、Johnson、A.、Lewis、J.、Raff、M.、Roberts、K。、＆Walter、P。（2002）。細胞の分子生物学。ガーランドサイエンス。
- ポラード、TD、およびアーンショー、WC（2004）。細胞生物学。サンダース。